穿心莲破坏内毒素作用的体外实验研究
作者：张霞 吴迪 王家泰 付强 崔乃杰
单位：天津市环湖医院ICU病房，天津 300060
关键词：穿心莲；内毒素；超微结构；巨噬细胞；细胞因子；中医药
中国中西医结合急救杂志000407摘要：目的：研究穿心莲是否具有体外破坏内毒素的作用。方法：①电镜观察经穿心莲作用后的脂多糖(LPS)构型变化。②观察穿心莲体外破坏LPS的量效关系。③观察穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子活性的影响。结果：电镜观察证实经穿心莲作用后的LPS已失去其正常结构，呈散乱分布的残破网或短带状，而且穿心莲体外破坏LPS作用在一定范围内随药物浓度的增加而提高。1g穿心莲约可裂解836 EU的LPS。同时，穿心莲能轻度增加体外正常腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1(IL1)和IL6的活性，显著抑制经LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌大量上述炎性细胞因子的活性，其作用在一定范围内呈剂量依赖性。结论：穿心莲在体外可通过直接破坏内毒素结构和抑制其所介导释放的大量炎性细胞因子活性起到拮抗内毒素的作用。
, 百拇医药
中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)04021203
Experimental studies of the destructive actions of andrographis paniculata nees on endotoxin in vitro
ZHANG Xia,WU Di,WANG Jiatai
Department of ICU，Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060
Abstract:Objective:To research the destructive action of andrographis paniculata nees(APN) on endotoxin in vitro.Methods:The structural changes of lipopolysaccharide(LPS) acted by APN,the relationship of the destructive action of APN on LPS between volume and efficacy in vitro and the influence of APN on activitie of inflammatory cytokines secreted by macrophages of peritoneal cavity stimulated by LPS in vitro were observed.Results:By means of electromicroscopic observation it was showed that LPS lost its normal structure and became scattered and destroyed netshape or shortbelt shape after the action of APN.The action of APN on destroying LPS in vitro was increased in certain extent as the concentrations were heightened.1 g of APN could cleavage about 836 EU LPS.Meanwhile,APN could slightly increase the activities of inflammatory cytokines 〔tumor necrosis factorα(TNFα),interleukin1(IL1) and IL6〕 secreted by the normal macrophages of peritoneal cavity,whereas it could significantly inhibit the activities of inflammtory cytokines secreted by the macrophages of peritoneal cavity stimulated by LPS.Furthermore,these action of APN were dosedependent.Conclusions:APN has the substantial action on destroying endotoxin in vitro through destroying the structure of LPS directly and inhibiting the activities of inflammtory cytokines induced by LPS.
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Key words:andrographis paniculata nees;endotoxin;ultrastructure;macrophage;cytokine;traditional Chinese medicine
CLC number:R965 Document code:A Artical ID:10089691(2000)04021203
内毒素血症是危重病的重要致病环节，常可导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多脏器功能障碍综合征(MODS)。如何拮抗、中和及摧毁内毒素是当前国内外研究的热点之一。我们通过大量的临床观察发现，某些革兰氏阴性菌感染的高热患者在使用穿心莲静脉制剂后，体温有所下降，脓毒症症状亦有所减轻。这一事实提示穿心莲可能对细菌、内毒素和炎性细胞因子有一定的拮抗和抑制作用。为此，我们对穿心莲破坏内毒素的作用进行了体外研究，报告如下。
1 材料与方法
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1.1 实验动物：纯系Balb/c雄性小鼠2只，8～10周龄，用于提取小鼠腹腔巨噬细胞；4～6周龄2只，雌雄不限，用于检测白介素(IL)。实验小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。
1.2 实验方法：
1.2.1 电镜观察脂多糖(LPS)结构：用0.1 mol/L Tris缓冲液配制成1 g/L 的精制大肠杆菌(E.Coli O111B4)LPS溶液(美国Sigma公司产品)，观察LPS的正常结构。将等量的脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐(以下简称穿心莲，中外合资哈尔滨三联药业有限公司产品)和LPS溶液混匀，使其终末浓度分别为5 g/L和1 g/L，置于水浴振荡器，于(55±2)℃水浴30分钟，观察穿心莲对LPS结构的破坏作用。按照文献〔1〕方法，用H600型透射电镜(日本日立公司产品)观察电镜下LPS结构，最终放大倍数为100 000倍。
, 百拇医药 1.2.2 穿心莲破坏LPS的量效关系：5 000 EU/L的LPS溶液作阳性对照。将等量的穿心莲和LPS溶液混匀，使它们的终末浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 g/L和5 000 EU/L，作实验观察。以上均为10个标本，置于(55± 2)℃水浴30分钟，调pH值为6.25～7.25，用鲎试剂盒Ⅱ(上海生物制品研究所产品)定量检测LPS，参照文献〔2〕方法，采用显色基质法，在全自动酶标仪(美国Metertech 公司产品 )上570 nm处测定终反应物吸光度，通过公式计算出LPS浓度，10个标本求取平均值，单位用EU/L表示。
1.2.3 穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1(IL1)和IL6活性的影响：按照文献〔3〕方法制备小鼠腹腔巨噬细胞，加入24孔板中。然后分别按需要加入含10%小牛血清的完全培养基作空白对照；含20 mg/L的LPS溶液作阳性对照；含40、20、10、5、2.5、1.25和0.625 g/L的穿心莲溶液作对比实验观察；含20 mg/L的LPS和上述系列浓度的穿心莲溶液作实验观察。每个反应做3个复孔，每孔反应体积为2 ml。将24孔板置于二氧化碳孵箱内(美国Napon公司产品)，于37 ℃、5%CO2培养48小时，轻轻吸取上清液，参照文献〔4〕方法，采用4甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma公司产品)比色法测定上清液中 TNFα、 IL1 和IL6的活性。最后在全自动酶标仪570 nm处测定终反应物吸光度，通过公式计算出活性值。TNFα以细胞毒效应的百分比(%)表示，IL1和 IL6以U/L表示。实验所需TNFα高度敏感细胞株WeHi164.13和IL6依赖细胞株KD83由北京医科大学免疫室惠赠。重组IL1和IL6标准品由美国DNAX分子细胞生物研究所惠赠。
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1.3 统计学方法：所得结果均用均数±标准差(x±s)表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 电镜观察LPS结构变化结果见图1、2。
2.2 穿心莲破坏LPS量效关系见图3。
2.3 穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌TNFα、IL1和 IL6活性的影响见图4。
图1 LPS正常结构(×100 000)
图2 经5 g/L穿心莲作用后的LPS结构(×100 000)
, 百拇医药
图3 穿心莲破坏LPS量效关系
IL1和IL6单位为kU/L,TNFα单位为%
图4 穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌
TNFα、IL1 和 IL6活性的影响
3 讨 论
3.1 穿心莲体外具有显著破坏内毒素作用：电镜观察发现LPS的正常结构呈较规则的网状或条带状；而经穿心莲作用后的LPS则呈散乱分布的残破网状、短带状，有的聚集成块，与多粘菌素B对LPS的作用相似〔1〕。定量实验研究证实，当穿心莲浓度为5 g/L时即有显著灭活LPS作用，破坏率达83.6%，而且此作用在一定范围内随穿心莲浓度的增加而提高，当穿心莲浓度为20 g/L时，破坏率达94.0%，继续增加其浓度，清除LPS效果并无显著增加。1 g穿心莲约可裂解836 EU的LPS。
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内毒素为存在于革兰氏阴性细菌细胞壁内的LPS，是一种具有三维空间结构的大分子物质〔5〕。一般说来，生物大分子物质的活性与其结构密切相关〔6〕，因而当内毒素结构遭到破坏后，就会失去其原有的生物活性。Rietschel〔7〕曾提出任何干扰内毒素结构或干扰含内毒素结构的细胞膜的药物都可以帮助杀死细菌。穿心莲直接摧毁了内毒素结构，因而可以有效地拮抗内毒素的多种生物学效应，从而起到显著破坏内毒素作用。
3.2 穿心莲在体外具有显著抑制内毒素诱导产生大量炎性细胞因子活性作用：穿心莲能轻度增加体外正常腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子的活性；同时显著抑制 LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子活性，而且以上作用在一定范围内(0.625～5 g/L)呈剂量依赖性，即随穿心莲浓度的增加而增强。当穿心莲浓度大于5 g/L时，上述作用并无显著增加。
内毒素对机体造成的损害，除其本身的毒性作用外，更主要的是由其所介导产生的以细胞因子为代表的多种内源性炎性介质的失控性释放，即各种内外源性介质所产生的一系列“瀑布样级联效应”，其中以TNF和IL与其关系最为密切〔8〕。本实验发现，穿心莲通过抑制内毒素所诱导的大量炎性细胞因子活性起到有效拮抗内毒素作用。
, 百拇医药
穿心莲是一味常用的清热解毒中药，具有清热解毒、凉血、消肿等作用〔9〕。从化学成分分析，穿心莲主要含内酯、内酯甙及黄酮类化合物。药理学研究证实穿心莲具有解热可以通过抑制其所介导的大量炎性细胞因子活性起到有效拮抗内毒素作用。
基金项目：天津市科委科研基金资助项目
作者简介：张 霞(1968)，女(汉族)，天津市人，硕士，医师。
参考文献：
〔1〕Lopes J,Inniss W E.Electron microscopy of effect of polymyxin on Escherichia coli,lipopolysaccharide.J Bacterial,1969,100:11281137.
〔2〕刘云海，刘军民，申正义，等.显色基质法检测板蓝根氯仿提取物的抗内毒素作用.同济医科大学学报，1995，24(1)：6970.
, http://www.100md.com
〔3〕杨贵贞主编.医用免疫学.第1版.吉林：吉林人民出版社，1980.402405.
〔4〕李会强，姚智，邢冬红，等.IL2、IL6及 TNFα MTT检测方法的建立.天津第二医学院学报，1993，9：46.
〔5〕Rietschel E T,Brade H.细菌内毒素.美国科学(中文版)，1992，12：914.
〔6〕顾天爵主编.生物化学.第3版.北京：人民卫生出版社，1988.3638.
〔7〕Rietschel E T.Bacterial endotoxin :molecular relationships between structure and activity.Inf Dis Clin North Am,1991,5(4):753768.
〔8〕姜玉峰，岳茂兴.解毒固本冲剂对小鼠肿瘤坏死因子α和白介素2及病理形态学改变的影响.中国中西医结合急救杂志，2000，7(1)：5456.
〔9〕凌一揆主编.中药学.第4版.上海：上海科学技术出版社，1992.3435.
〔10〕邓文龙，王文烈.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐注射液的药理作用研究.中草药通报，1980，2：3640.
(收稿日期：1999-09-16)
(修回日期：2000-04-10), http://www.100md.com
单位：天津市环湖医院ICU病房，天津 300060
关键词：穿心莲；内毒素；超微结构；巨噬细胞；细胞因子；中医药
中国中西医结合急救杂志000407摘要：目的：研究穿心莲是否具有体外破坏内毒素的作用。方法：①电镜观察经穿心莲作用后的脂多糖(LPS)构型变化。②观察穿心莲体外破坏LPS的量效关系。③观察穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子活性的影响。结果：电镜观察证实经穿心莲作用后的LPS已失去其正常结构，呈散乱分布的残破网或短带状，而且穿心莲体外破坏LPS作用在一定范围内随药物浓度的增加而提高。1g穿心莲约可裂解836 EU的LPS。同时，穿心莲能轻度增加体外正常腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1(IL1)和IL6的活性，显著抑制经LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌大量上述炎性细胞因子的活性，其作用在一定范围内呈剂量依赖性。结论：穿心莲在体外可通过直接破坏内毒素结构和抑制其所介导释放的大量炎性细胞因子活性起到拮抗内毒素的作用。
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中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)04021203
Experimental studies of the destructive actions of andrographis paniculata nees on endotoxin in vitro
ZHANG Xia,WU Di,WANG Jiatai
Department of ICU，Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060
Abstract:Objective:To research the destructive action of andrographis paniculata nees(APN) on endotoxin in vitro.Methods:The structural changes of lipopolysaccharide(LPS) acted by APN,the relationship of the destructive action of APN on LPS between volume and efficacy in vitro and the influence of APN on activitie of inflammatory cytokines secreted by macrophages of peritoneal cavity stimulated by LPS in vitro were observed.Results:By means of electromicroscopic observation it was showed that LPS lost its normal structure and became scattered and destroyed netshape or shortbelt shape after the action of APN.The action of APN on destroying LPS in vitro was increased in certain extent as the concentrations were heightened.1 g of APN could cleavage about 836 EU LPS.Meanwhile,APN could slightly increase the activities of inflammatory cytokines 〔tumor necrosis factorα(TNFα),interleukin1(IL1) and IL6〕 secreted by the normal macrophages of peritoneal cavity,whereas it could significantly inhibit the activities of inflammtory cytokines secreted by the macrophages of peritoneal cavity stimulated by LPS.Furthermore,these action of APN were dosedependent.Conclusions:APN has the substantial action on destroying endotoxin in vitro through destroying the structure of LPS directly and inhibiting the activities of inflammtory cytokines induced by LPS.
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Key words:andrographis paniculata nees;endotoxin;ultrastructure;macrophage;cytokine;traditional Chinese medicine
CLC number:R965 Document code:A Artical ID:10089691(2000)04021203
内毒素血症是危重病的重要致病环节，常可导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多脏器功能障碍综合征(MODS)。如何拮抗、中和及摧毁内毒素是当前国内外研究的热点之一。我们通过大量的临床观察发现，某些革兰氏阴性菌感染的高热患者在使用穿心莲静脉制剂后，体温有所下降，脓毒症症状亦有所减轻。这一事实提示穿心莲可能对细菌、内毒素和炎性细胞因子有一定的拮抗和抑制作用。为此，我们对穿心莲破坏内毒素的作用进行了体外研究，报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验动物：纯系Balb/c雄性小鼠2只，8～10周龄，用于提取小鼠腹腔巨噬细胞；4～6周龄2只，雌雄不限，用于检测白介素(IL)。实验小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。
1.2 实验方法：
1.2.1 电镜观察脂多糖(LPS)结构：用0.1 mol/L Tris缓冲液配制成1 g/L 的精制大肠杆菌(E.Coli O111B4)LPS溶液(美国Sigma公司产品)，观察LPS的正常结构。将等量的脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐(以下简称穿心莲，中外合资哈尔滨三联药业有限公司产品)和LPS溶液混匀，使其终末浓度分别为5 g/L和1 g/L，置于水浴振荡器，于(55±2)℃水浴30分钟，观察穿心莲对LPS结构的破坏作用。按照文献〔1〕方法，用H600型透射电镜(日本日立公司产品)观察电镜下LPS结构，最终放大倍数为100 000倍。
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1.2.3 穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1(IL1)和IL6活性的影响：按照文献〔3〕方法制备小鼠腹腔巨噬细胞，加入24孔板中。然后分别按需要加入含10%小牛血清的完全培养基作空白对照；含20 mg/L的LPS溶液作阳性对照；含40、20、10、5、2.5、1.25和0.625 g/L的穿心莲溶液作对比实验观察；含20 mg/L的LPS和上述系列浓度的穿心莲溶液作实验观察。每个反应做3个复孔，每孔反应体积为2 ml。将24孔板置于二氧化碳孵箱内(美国Napon公司产品)，于37 ℃、5%CO2培养48小时，轻轻吸取上清液，参照文献〔4〕方法，采用4甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma公司产品)比色法测定上清液中 TNFα、 IL1 和IL6的活性。最后在全自动酶标仪570 nm处测定终反应物吸光度，通过公式计算出活性值。TNFα以细胞毒效应的百分比(%)表示，IL1和 IL6以U/L表示。实验所需TNFα高度敏感细胞株WeHi164.13和IL6依赖细胞株KD83由北京医科大学免疫室惠赠。重组IL1和IL6标准品由美国DNAX分子细胞生物研究所惠赠。
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1.3 统计学方法：所得结果均用均数±标准差(x±s)表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 电镜观察LPS结构变化结果见图1、2。
2.2 穿心莲破坏LPS量效关系见图3。
2.3 穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌TNFα、IL1和 IL6活性的影响见图4。
图1 LPS正常结构(×100 000)
图2 经5 g/L穿心莲作用后的LPS结构(×100 000)
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图3 穿心莲破坏LPS量效关系
IL1和IL6单位为kU/L,TNFα单位为%
图4 穿心莲对LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌
TNFα、IL1 和 IL6活性的影响
3 讨 论
3.1 穿心莲体外具有显著破坏内毒素作用：电镜观察发现LPS的正常结构呈较规则的网状或条带状；而经穿心莲作用后的LPS则呈散乱分布的残破网状、短带状，有的聚集成块，与多粘菌素B对LPS的作用相似〔1〕。定量实验研究证实，当穿心莲浓度为5 g/L时即有显著灭活LPS作用，破坏率达83.6%，而且此作用在一定范围内随穿心莲浓度的增加而提高，当穿心莲浓度为20 g/L时，破坏率达94.0%，继续增加其浓度，清除LPS效果并无显著增加。1 g穿心莲约可裂解836 EU的LPS。
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内毒素为存在于革兰氏阴性细菌细胞壁内的LPS，是一种具有三维空间结构的大分子物质〔5〕。一般说来，生物大分子物质的活性与其结构密切相关〔6〕，因而当内毒素结构遭到破坏后，就会失去其原有的生物活性。Rietschel〔7〕曾提出任何干扰内毒素结构或干扰含内毒素结构的细胞膜的药物都可以帮助杀死细菌。穿心莲直接摧毁了内毒素结构，因而可以有效地拮抗内毒素的多种生物学效应，从而起到显著破坏内毒素作用。
3.2 穿心莲在体外具有显著抑制内毒素诱导产生大量炎性细胞因子活性作用：穿心莲能轻度增加体外正常腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子的活性；同时显著抑制 LPS刺激体外腹腔巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子活性，而且以上作用在一定范围内(0.625～5 g/L)呈剂量依赖性，即随穿心莲浓度的增加而增强。当穿心莲浓度大于5 g/L时，上述作用并无显著增加。
内毒素对机体造成的损害，除其本身的毒性作用外，更主要的是由其所介导产生的以细胞因子为代表的多种内源性炎性介质的失控性释放，即各种内外源性介质所产生的一系列“瀑布样级联效应”，其中以TNF和IL与其关系最为密切〔8〕。本实验发现，穿心莲通过抑制内毒素所诱导的大量炎性细胞因子活性起到有效拮抗内毒素作用。
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穿心莲是一味常用的清热解毒中药，具有清热解毒、凉血、消肿等作用〔9〕。从化学成分分析，穿心莲主要含内酯、内酯甙及黄酮类化合物。药理学研究证实穿心莲具有解热可以通过抑制其所介导的大量炎性细胞因子活性起到有效拮抗内毒素作用。
基金项目：天津市科委科研基金资助项目
作者简介：张 霞(1968)，女(汉族)，天津市人，硕士，医师。
参考文献：
〔1〕Lopes J,Inniss W E.Electron microscopy of effect of polymyxin on Escherichia coli,lipopolysaccharide.J Bacterial,1969,100:11281137.
〔2〕刘云海，刘军民，申正义，等.显色基质法检测板蓝根氯仿提取物的抗内毒素作用.同济医科大学学报，1995，24(1)：6970.
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〔3〕杨贵贞主编.医用免疫学.第1版.吉林：吉林人民出版社，1980.402405.
〔4〕李会强，姚智，邢冬红，等.IL2、IL6及 TNFα MTT检测方法的建立.天津第二医学院学报，1993，9：46.
〔5〕Rietschel E T,Brade H.细菌内毒素.美国科学(中文版)，1992，12：914.
〔6〕顾天爵主编.生物化学.第3版.北京：人民卫生出版社，1988.3638.
〔7〕Rietschel E T.Bacterial endotoxin :molecular relationships between structure and activity.Inf Dis Clin North Am,1991,5(4):753768.
〔8〕姜玉峰，岳茂兴.解毒固本冲剂对小鼠肿瘤坏死因子α和白介素2及病理形态学改变的影响.中国中西医结合急救杂志，2000，7(1)：5456.
〔9〕凌一揆主编.中药学.第4版.上海：上海科学技术出版社，1992.3435.
〔10〕邓文龙，王文烈.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐注射液的药理作用研究.中草药通报，1980，2：3640.
(收稿日期：1999-09-16)
(修回日期：2000-04-10), http://www.100md.com
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